化學發(fā)光基礎(chǔ)知識

一、什么是化學發(fā)光，與放免、酶免比較有何不同？

化學發(fā)光免疫分析（Chemiluminescence Immunoassay，CLIA)是將化學發(fā)光與免疫反應相 結(jié)合，用于檢測微量抗原或抗體的一種新型標記免疫測定技術(shù)。

化學發(fā)光免疫分析比放射免疫，酶聯(lián)免疫具有更高靈敏度，具備操作簡便、快速的特點， 易于標準化操作。且測試中不使用有害的試劑，試劑保存期長，應用于生物學、醫(yī)學研究和臨床 實驗診斷工作，成為非放射性免疫分析法中最有前途的方法之一。

(1) 與放免（RIA)產(chǎn)品比較

與放射免疫試劑（RIA)比較，化學發(fā)光避免了放射性核素的污染以及對操作人員的傷害， 大大縮短了反應時間，同時兼具高靈敏度的優(yōu)勢。

(2) 與酶免（ELISA)產(chǎn)品比較

靈敏度與可測范圍遠遠高于酶免產(chǎn)品，兼具ELISA法簡便的操作方法與較短的反應時間。

二、什么是標記免疫技術(shù)，它的三大要素是什么？

將Ag或Ab用標記物(如熒光素、酶、放射性同位素、化學發(fā)光物質(zhì)等)進行標記，在與標本 中的相應Ab或Ag反應后，可以不必測定Ag-Ab復合物本身，而測定復合物中的標記物，通過標 記物的放大作用，進一步提高了免疫技術(shù)的敏感性。

三要素：通常在檢測系統(tǒng)中會使用到一種叫標記物（labeling)的物質(zhì)，常標記在抗體上 通常會有一個分離（separation)的過程在最后讀取信號前 需要去仔細關(guān)注一下分析的模式（format)

三、標記免疫技術(shù)主要有哪幾種？

主要經(jīng)歷了四種標記免疫技術(shù)的發(fā)展：

熒光素(Fluorophores) - FIA

放射性同位素(Radioisotopes) - RIA

酶（Enzymes) - EIA

化學發(fā)光物質(zhì)-CLIA

四、化學發(fā)光原理？ 分析方法及過程

釆用微孔板作為固相載體，以魯米諾作為發(fā)光劑，固相載體的應用擴大了測定的范圍。以競爭法、夾心法等免疫測定方法為基礎(chǔ)。每個試劑盒都包含標準品、酶結(jié)合物、底物、洗液、包被板，降低了試劑成本，減少了交叉污染，保證了檢測質(zhì)量。

⑴、抗原抗體結(jié)合：將待測標本加入包被單克隆抗體的微孔板中，標本中的抗原與微孔板的抗體結(jié)合，再加入辣根過氧化物酶標記的抗體，經(jīng)溫育后形成固相包被抗體-抗原-酶標記抗體復合物。

⑵、洗滌、分離：經(jīng)過5次洗滌，很快將未結(jié)合的多余抗原和酶標記抗體洗去。

⑶、加入底物luminol發(fā)光劑：luminol被結(jié)合在微孔板的辣根過氧化物酶的催化下可以催化經(jīng)過過氧化氫的分解，使過氧化氫變成水和單氧，其中單氧可氧化魯米諾，魯米諾經(jīng)氧化后可發(fā)出藍光。這種化學發(fā)光持續(xù)時間長，可達數(shù)小時之久。通過光量子閱讀系統(tǒng)記錄發(fā)光強度，并從標準曲線上計算出待測抗原的濃度。

五、什么是鉤狀效應（hook effect)，如何判斷及解決？

免疫測定的實質(zhì)是抗原抗體反應，抗原抗體反應是按?定的分子比例結(jié)合，當二者比例適中 時，形成的免疫反應最強烈，形成復合物或檢測的信號與所測的抗原或抗體成比例關(guān)系，但當抗 原或抗體其中一者過量時，免疫反應將減弱，測定值呈現(xiàn)假性低值。

在化學發(fā)光中像二步分析法…般都能避免鉤狀效應，對于一步夾心法項目說明書中都提到了 產(chǎn)生鉤狀效應的上限如人絨毛膜促性腺激素的鉤狀效應值是100萬在實際工作中如遇到 測定值與臨床嚴重不符的結(jié)果要考慮到鉤狀效應，解決辦法是稀釋此樣本。

六、什么是嗜異性抗體？

病人樣品中可能自然產(chǎn)生一些針對動物免疫球蛋白的抗體(通常是鼠或羊)，-般來源于暴露于這些動物或接受過動物血清的治療，分析的干擾：可以在雙單克隆夾心法分析模式中引起假陽性，可以在單克隆/多克隆分析模式中出現(xiàn)假陰性。

廠家在試劑生產(chǎn)中會加入封閉劑，封閉劑可以加在反應基質(zhì)中或整合在試劑盒內(nèi)：鼠（鼠科 類)，鳥（鳥科類）和羊蛋白，各個廠家生產(chǎn)的分析試劑都有可能會不同程度的受到任何一個病人血清的影響！當遇到與臨床不符的結(jié)果時要詢問病史看是否有嗜異性抗體的干擾。

七、什么是基質(zhì)效應？

基質(zhì)是指的是樣品中被分析物以外的組分?；|(zhì)常常對分析物的分析過程有顯著的干擾，并影響分析結(jié)果的準確性。目前最常用的去除基質(zhì)效應的方法是，通過已知分 析物濃度的標準樣品，同時盡可能保持樣品中基質(zhì)不變，建立一個校正曲線（calibration curve)。

八、稀釋樣品時稀釋物不對為何有基質(zhì)效應？

我們在稀釋樣品時要考慮到基質(zhì)效應的影響，稀釋必須在適當?shù)幕|(zhì)中進行，對于 大多數(shù)測定而言，適當?shù)幕|(zhì)就是零校準品，如果分析物稀釋基質(zhì)效應中所含成分濃度不正 確，稀釋回收率就不能對它們進行準確的測定，因為它們稀釋后會與Bing agent形成新的平衡。

九、如何看待說明書中的方法局限性？

此章節(jié)的內(nèi)容極為重要，實驗室工作人員必須對其進行理解，因為它關(guān)系到實驗室能否對 樣本分析結(jié)果進行正確的解釋。在解釋結(jié)果時，需參照該病人的整體臨床情況，包括：癥狀、 臨床病史以及其它測試所得的數(shù)據(jù)和其它相應的信息。

十、如何理解最高可報告值？

當樣品濃度高時，可以報告大于最高校準品值的結(jié)果，有些試劑生產(chǎn)商的的測定系統(tǒng)通常 用亮點調(diào)整來代替完全校準，這樣的話他們可報告范圍是一個擬合而出的最高水平（而非 實際測定值)。而在ACCESS檢測系統(tǒng)中，用戶自己創(chuàng)建了標準曲線，當該標準曲線意境通 過并且質(zhì)控檢測被接受時，就可以證實其可報告的上限。當樣本分析所得的RLU值高于最 高校準品時，以樣本結(jié)果大于最高校準品值的形式報告，多數(shù)實驗室對大多數(shù)測定項目的 分析結(jié)果使用這種直接報告模式，如果需要獲得確切的測定值，則需要進行機外人工稀釋 并重新分析樣本。

十一、如何理解最低可報告值？

所有的定景測定在曲線的下端通常都有一個零標準，該標準允許計算結(jié)果低至零，當測定 結(jié)果越接近零時，測定結(jié)果就越不那么精確。在說明書中給出了項目的檢測最低下限，建 議以低于該下限來報告結(jié)果。

十二、什么是分析靈敏度？

分析零敏度通常是對標準曲線上的零點校準品距零值的2SD值范圍來進行測定計算的（而 SD值是將零校準品作為未知濃度樣品經(jīng)多管檢測后計算均值所得）

十三、什么是功能靈敏度？

功能靈敏度(Functional sensitivity)為<20%CV時所能檢測到的最低極限濃度，它反映在實際樣品檢測時所能達到精確定量的檢測極限。

十四、如何理解說明書中的稀釋回收率？

稀釋回收率與稀釋線性不不完全是一回事，但是二者可用同一個研究方式來檢驗，要進行 稀釋回收率測定首先用戶需要選取…個已知濃度的病人樣本，在分析項目的線性范圍內(nèi)對 其進行多點稀釋后進行檢測，如果所測得結(jié)果與最初的樣本稀釋系數(shù)結(jié)果相匹配，那么就 驗證了稀釋回收率與檢測線性范圍。稀釋線性與回收率的區(qū)別在于，將一組分析物校準品 當未知樣品進行分析，來對其檢測線性范圍進行驗證。

十五、定標液為凍干粉的些注意事項？

如 T3、T4、FT3、FT4、TSH等

凍干粉定標液復溶：復溶水的水質(zhì)加樣容器的準確度加樣的技術(shù)混勻/旋轉(zhuǎn)

復溶后定標液保存：使用合適的冷凍保存試管正確標簽無霜冰箱保存

十六、化學發(fā)光項目是否可以使用血漿等其他樣本類型，有無影響？

并不是所有的免疫項目都可以使用血漿，具體請參閱項目說明書，但為了避免不同項目樣本類型的差異，同時保證同一患者使用同樣的樣本類型，因此我們推薦統(tǒng)一使用血清樣本。

十七、樣本溶血、脂血對化學發(fā)光結(jié)果項目有影響嗎？

樣本溶血、脂血、黃疸對化學發(fā)光項目同樣是有影響的，不過影響機制與影響比色等 項S不同。如溶血對胰島素影響是因為樣本溶血后紅細胞釋放種胰島素滅活酶而使樣 本中胰島素濃度減少。不同項目對樣本禁忌要求不同，具體請査閱“化學發(fā)光項目速査 樣本禁忌內(nèi)容”。

十八、樣本分析前處理都應該注意什么？

有以下幾點需特別注意：

一、采血管質(zhì)量，有無失效，添加劑是否適當，釆血員專業(yè)水平

二、釆血量是否適當，是否及時進行混勻，血漿應該8-10次，血清應該5次。

三、血清凝固時間是否充足，離心是否徹底，離心機是否定期校正。

四、貯存條件是否適當。

十九、什么是分析靈敏度和功能靈敏度？

最低檢測濃度/極限(Minimal detectable concentration/limit, MDC/MDL)是反映最低可 區(qū)別于

零值的濃度，又稱分析靈敏度(Analytical sensitivity)。功能靈敏度(Functional sensitivity)

為<20%CV時所能檢測到的最低極限濃度，它反映在實際樣品檢測時所能達到 精確定暈的檢測極限。

二十、切點(Cut-off)的概念是什么？

最理想的切點是能將二個不同人群完全分開，例如疾病人群和正常人群。而實際狀況是人群之間會有一個交叉，所以切點就只能在臨床靈敏度和特異性之間尋找一個相對的平衡點，也就是說需符合臨床的大多數(shù)的需求。